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      膠體金偶聯過程需要注意的幾個問題

      在實際工作中,在金溶膠中加入蛋白質后,會由于靜電、疏水和范德華力相互作用而引發其在金顆粒表面的自發吸附,這是膠體金標記得以進行的基礎。離開這個基礎,膠體金標記是沒辦法進行的。


      為了制備金顆粒標記的蛋白質,通常先將將金懸浮液攪拌混勻(你肯定遇到過這種情況:如果顆粒比較大,放置一段時間會出現顆粒下沉,注意此處不是金顆粒形態發生變化導致的聚沉!而只是因為重力作用引起的正常金顆粒在溶液中的非均勻分布。因此標記時候需要混勻后使用),同時加入大量的蛋白質。當金顆粒與蛋白質分子結合時,隨著金顆粒變得穩定和裸金顆粒的減少,特征波長處的吸光度通常會下降。為了檢查吸附過程的完整性,并確定金顆粒是否完全被飽和標記,我們可以取一部分液體,并加入少量氯化鈉溶液。如果在加入氯化鈉后發生聚沉,則說明金顆粒還有沒被蛋白吸附存在比較多的裸金顆粒,應該添加更多的蛋白質來進一步吸附裸金顆粒。最后,通常會添加聚乙二醇(PEG)或免疫反應阻斷劑,如BSA或脫脂奶粉溶液,來進一步穩定蛋白質結合后的膠體懸液。這些封閉蛋白基本會完全占據絕大分部分潛在的金-金復合物或金-蛋白復合物相互作用的剩余位點,從而防止了在存儲、檢測過程中的聚集或非特異性結合。


      關于待標記蛋白用量,大部分研發人員通常的做法是:先確定防止Nacl造成的聚集的最少蛋白質所需量,在此基礎上增加約10-20%的過量蛋白(霍里斯伯格和羅塞特,1977;De Mey等人,1981)。但這個確定蛋白具體用量多少的工作其實針對大部分項目或者新手研發人員來說,已經沒有太多必要去動手再確定到底多少蛋白才是最少量,除非是項目蛋白成本很高,你可以去做個試驗往下走走好好降降成本。膠體金技術這么多年下來,N多的被后浪拍在沙灘上且已經被曬得嘎嘣脆的研發前輩早已經留下了適合絕大部分項目標記的蛋白使用量。通常來說10ug/ml的用量已經絕對能讓你的蛋白豐度夠到姥姥家了,筆者甚至試過3ug/ml的用量姥姥家都表示夠用了。但是需要注意的是,如果你使用的金溶液濃度比較高的話,還是需要相應按照適當的比例提高蛋白的使用量,否則姥姥就有可能告訴你蛋白用量有點點不那么給力了。


      總體來說,為了獲得比較理想的標記物之外,在用金顆粒標記蛋白質時,需要考慮幾個參數:


      (1)蛋白質的pI,

      (2)吸附過程的pH,

      (3)標記反應中的蛋白質的量。


      一般認為,大多數蛋白質可以在其等電點或附近最大限度地和膠體金顆粒進行吸附(Norde,1986)。但是就pH這個參數,在金標記過程中再怎么強調也不為過,甚至可以說“成也pH,敗也pH”.這個參數對憑金標記這個技能混江湖的人來說絕對算得上是內家真氣般的存在。沒有一定程度的修煉是不好去江湖隨便飄的。甚至有些待標記蛋白的純度、性能決定了標記過程pH會出現和常規做法特別不一樣的要求,先舉例說明如下:


      A、對于許多蛋白質,特別是抗血清來源的免疫球蛋白,平均pI是一個包含一系列pH值的范圍。因此,多克隆抗體制備可能具有與特定純化的單克隆抗體非常不同的平均pI。這一點相信廣大金標研發人員是有所體會的,通常就是多抗比較好標記,但是活性不盡如人意,單抗雖然沒多抗好標,但標記出來后效果喜人。原因就在于此。


      B、另外一點,個別蛋白對pH非常挑剔,當你用第一步調整好pH的金溶液中加入蛋白后,一切反應都很和諧、美好,反應的頁面也很絲滑,但當你第二次加入封閉蛋白后滿懷希望的等待收貨美好的標記物時,詭異、慘烈的畫面通常會出來把你英俊瀟灑的臉摁花崗巖地面上摩擦一頓:你會發現溶液會慢慢的、逐漸的變成藍色、或者紫色,甚至會有沉淀析出,人品差的他最后直接會給你變成一汪清水!咦,他怎么就變色兒呢?他怎么能變色了呢!問題是,你這一變色兒,你讓你旁邊新招來的實驗助手小妹妹對你那崇拜的眼神往何處安放?!是啊,他怎么就變色兒了呢?其實,這個問題主要是就是待帶標記蛋白對pH非常敏感造成的,加入封閉蛋白后改變了溶液pH所致,需要你在加入封閉蛋白過程中持續穩定溶液的pH才能讓標記過程進行下去。


      就算你確定好了標記pH,咱們通常會加入碳酸鉀到金溶液里邊去,然后再攪拌。但是,我告訴你,你如果對你的pH計下手夠狠的話,你可以用探頭直接伸入到你的金溶液里邊,然后睜大眼睛瞅個faiwu分鐘,我保證你會看見一個魔幻的情況出現:你調整好的金溶液的pH它就像遙遠星空的星光一樣一閃一閃的在你眼前欻欻跳動并且一直往下降。通常faiwu分鐘估計至少能給你掉個0.5個pH!厲害吧,刺激吧?是不是又聽到了你那英俊的臉和花崗巖摩擦的呲呲聲!開始我遇到這種情況就傻眼了,心想:這啥情況哇!那啥、實驗前我特意用清水洗手了三遍吶!看見小偷偷東西我也喊了呀!公交車上我也給老奶奶讓座了哇,過斑馬線我也沒闖紅燈撒。臥槽,肯定是過馬路的時候走在我身邊的老奶奶我沒扶她!其實不是我不想扶她,是她走路速度比我快!等你在心里對心靈徹底來一次滌蕩后,我們來處理這個問題,原則就是:多次平衡,盡快結合。多次平衡控制pH的下降幅度,盡快結合縮短波動時間。


      雖然我們說蛋白質與金顆粒的標記沒有普遍一致的標準,但可以通過遵循下面這些一般準則來提高標記過程的效率:


      (1)在pH的pI范圍內或略高于pI;但在實際中往往這個策略效果一般,真的勇者往往出其不意而獲得意外之喜。期待你也一樣!大膽往往能讓你成為整個實驗室最靚的仔!


      (2)向金顆粒注入的蛋白質量比氯化鈉破壞實驗時略高(約10%);


      (3)避免蛋白質的高飽和,因為這可能會促進結合材料的浸出;這點真的可以采納,10ug/ml用量絕對姥姥家夠了,甚至舅舅家也都夠了。省時間可以直接用這個量,省出寶貴時間給實驗助手培訓下理論和實驗注意事項的細節它不香嗎?


      (4)通過測定溶液在特征波長處的吸光度來評價金顆粒的吸附程度和聚沉程度;


      (5)優化每個蛋白質-金顆粒偶聯物,來確定膠體的穩定性和活性。優化工作是個細活,需要花時間和精力去做、熬,這是也絕大部分小白菜成長為大神的最好的路、其實也是最好的捷徑。這個工作相當于在對標記工作做PDCA持續改進,同時、他對你獲取、維持實驗室標記崗位的王霸之位有舉足輕重的作用,實踐出真知,真知出權威。


      如此,只要是在每次標記的過程中出現詭異事件,江湖的朋友會不約而同的翹首以盼且眾望所歸于你身上,希望你重出江湖,一劍定乾坤!當然也少不了收獲你助手小妹妹那崇拜的眼光!

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